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基于PI3K/AKT信号通路及自噬探讨恒清Ⅰ号方治疗血管性痴呆的作用机制

时间:2020-12-30 08:15

来源:未知作者:admin点击:

摘    要:目的 基于PI3K/AKT信号通路及自噬研究恒清Ⅰ号方治疗血管性痴呆的作用机制。方法 将60只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、恒清Ⅰ号方低剂量组、恒清Ⅰ号方中剂量组、恒清Ⅰ号方高剂量组和欧来宁组,每组10只。除假手术组外,其余组均采用双侧颈总动脉永久性结扎法建模。术后7 d,恒清Ⅰ号方低、中、高剂量组分别给予0.268 g/mL、0.535 g/mL、1.070 g/mL的恒清Ⅰ号方灌胃,欧来宁组给予欧来宁14.8 g/kg灌胃,假手术组、模型组给予等量生理盐水灌胃,均2次/d,持续灌胃30 d。灌胃结束后采用Morris水迷宫实验测试各组大鼠的逃避潜伏期、穿越平台次数,以ELISA法检测海马组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、核因子-κB(NF-κB)含量,以Western blot法检测海马组织中PI3K、AKT、p-AKT、LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ蛋白表达情况。结果 水迷宫实验第1~4天,模型组大鼠逃避潜伏期均明显长于假手术组(P均<0.05);恒清Ⅰ号方中、高剂量组和欧来宁组大鼠逃避潜伏期均明显短于模型组和恒清Ⅰ号方低剂量组(P均<0.05),且恒清Ⅰ号方高剂量组明显短于恒清Ⅰ号方中剂量组和欧来宁组(P均<0.05);模型组大鼠穿越平台次数明显少于假手术组(P<0.05),恒清Ⅰ号方中、高剂量组和欧来宁组大鼠穿越平台次数均明显多于模型组和恒清Ⅰ号方低剂量组(P均<0.05),且恒清Ⅰ号方高剂量组明显多于恒清Ⅰ号方中剂量组和欧来宁组(P均<0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠海马组织中TNF-α、NF-κB含量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显增高(P均<0.05),PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达量均明显降低(P均<0.05);与模型组和恒清Ⅰ号方低剂量组比较,恒清Ⅰ号方中、高剂量组和欧来宁组大鼠海马组织中TNF-α、NF-κB含量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显降低(P均<0.05),PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达量均明显升高(P均<0.05);与恒清Ⅰ号方中剂量组和欧来宁组比较,恒清Ⅰ号方高剂量组大鼠海马组织中TNF-α、NF-κB含量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显降低(P均<0.05),PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达量均明显升高(P均<0.05)。结论 恒清Ⅰ号方可以呈量效关系改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力,且高剂量恒清Ⅰ号方的作用优于欧来宁,可能与其抑制炎症反应、阻滞细胞自噬和调控PI3K/AKT信号通路有关。
关键词:恒清Ⅰ号方 血管性痴呆 PI3K/AKT信号通路 肿瘤坏死因子-α 核因子-κB

血管性痴呆是由一系列脑血管病导致的以认知、记忆功能减退为主,伴有语言、视空间辨别技能、情感人格障碍为特征的中枢神经系统进行性损害疾病[1],是仅次于阿尔茨海默病的世界范围内最常见的老年痴呆症,占所有痴呆病例的15%~20%,也是迄今唯一可预防的痴呆类型[2]。血管性痴呆发病机制复杂,多途径干预治疗是防治血管性痴呆的新方向。中药复方具有多靶点、多途径、多层次等作用特点和独特优势,本课题组在长期临床实践中总结出治疗血管性痴呆效果显著的中药复方恒清Ⅰ号方[3-4],本实验基于PI3K/AKT信号通路探讨了该方对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的影响,现将结果报道如下。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物
SPF级健康雄性10周龄SD大鼠80只,体质量(300±50)g,购买于上海灵畅生物科技有限公司,动物生产许可证号:SCXK(沪)2018-003,饲养于上海吉凯基因化学技术有限公司动物房。随意饮水和进食。温度(22±2)℃,相对湿度(60±5)%,12 h光照。
1.2 主要药品
恒清Ⅰ号方由益智仁30 g、菟丝子15 g、川芎15 g、石菖蒲20 g、熟地黄15 g、杜仲15 g、地龙10 g(冲服)、郁金15 g、天麻10 g、钩藤10 g组成,药物均由上海市第六人民医院中药房提供,经上海市第六人民医院临床药理室鉴定合格。称取以上中药饮片,放入圆底烧瓶中并混匀,用8倍量超纯水浸泡30 min,冷凝回流提取1 h后收集药液;6倍量超纯水加入到药渣中,冷凝回流提取1 h后收集药液;混均全部药液,纱布过滤后收集滤液;采用旋转蒸发仪浓缩药液,并以中质量浓度匹配临床的实际用药浓度。中质量浓度浓缩至0.535 g/mL,恒清Ⅰ号方低剂量为0.268 g/mL,中剂量为0.535 g/mL,高剂量为1.070 g/mL,保存于-20 ℃冰箱。使用前在室温下解冻。欧来宁(奥拉西坦胶囊)为石药集团欧意药业有限公司生产,国药准字H20031033,批号:059190102,规格:0.4 g/粒。
1.3 主要试剂
Akt(pan)Rabbit mAb(批号:C86E9)、PI3 Kinase p110α Rabbit mAb(批号:C96F6)、Phospho-Akt(D9E)XP®Rabbit mAb(批号:Ser586),LC3A/B XP®Rabbit mAb(批号:D6U3E),均为广州聚研生物科技有限公司产品。
1.4 分组、造模及干预方法
SD大鼠适应性饲养1周后,随机分为假手术组、模型组、恒清Ⅰ号方低剂量组、恒清Ⅰ号方中剂量组、恒清Ⅰ号方高剂量组和欧来宁组,每组10只。采用双侧颈总动脉永久性结扎法建立模型:术前禁食12 h、禁水4 h。10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后,将大鼠仰卧位固定在手术台上,颈部皮肤消毒,取颈部正中切口,钝性分离肌肉,暴露双侧颈总动脉并将其与迷走神经分离;假手术组在分离迷走神经后不结扎而直接缝合,其余组结扎双侧颈总动脉,然后缝合。术后7 d,恒清Ⅰ号方低、中、高剂量组分别对应给予低剂量、中剂量、高剂量恒清Ⅰ号方灌胃,欧来宁组给予欧来宁溶液灌胃(给药浓度依据人和动物体表面积折算系数换算[5],计算结果为14.8 g/kg),假手术组、模型组给予等体积生理盐水灌胃,均为2次/d,持续灌胃30 d。
1.5 观察指标及方法
1.5.1 Morris水迷宫实验
末次灌胃后第2天,以Morris水迷宫实验检测各组大鼠的学习记忆能力。①定位航行实验:连续训练大鼠5 d,把其按顺时针方向依次由第1,2,3,4象限入水点顺序放入水中,记录90 s内大鼠寻找平台的时间,即逃避潜伏期。②空间探索实验:撤去平台,在第1象限相同的入水点,把大鼠面向池壁放入水中,计算其1 min内穿越原平台位置的次数。
1.5.2 海马组织中TNF-α、NF-κB含量检测
以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,4%多聚甲醛心脏灌注后,剪断大鼠头部,剥离颅骨表面组织、皮肤,枕骨大孔中剖开枕骨,暴露小脑、脑干,剥离颅骨,剪断颅神经,分离脑组织与颅底,剥离嗅脑,提取脑组织,分离皮质、海马,置于冻存管并保存于-80 ℃冰箱。参照ELISA试剂盒说明书检测海马组织中TNF-α、NF-κB含量。
1.5.3 海马组织中PI3K、AKT、p-AKT及LC3蛋白表达检测
称取大鼠海马组织,加入RIPA裂解液,匀浆,4 ℃、13 000 r/min离心15 min,BCA蛋白定量法测定上清液蛋白浓度。加上样缓冲液和RIPA制备样品,上样量100 μg蛋白,经SDS-PAGE电泳后,转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭2 h,加入一抗过夜、洗涤;加入二抗,室温孵育1 h,ECL显影、扫描。Western blot条带扫描后运用Image Lab软件计算其OD值。
1.6 统计学方法
SPSS 21.0统计软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差(x¯±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠逃避潜伏期、穿越平台次数比较
与假手术组比较,模型组大鼠第1~4天的逃避潜伏期均明显延长(P均<0.05),穿越平台次数明显减少(P<0.05)。与模型组和恒清Ⅰ号方低剂量组比较,恒清Ⅰ号方中、高剂量组和欧来宁组大鼠第1~4天的逃避潜伏期均明显缩短(P均<0.05),穿越平台次数明显增加(P均<0.05)。与恒清Ⅰ号方中剂量组和欧来宁组比较,恒清Ⅰ号方高剂量组大鼠第1~4天的逃避潜伏期更短(P均<0.05),穿越平台次数更多(P均<0.05)。见表1。
表1 各组大鼠Morris水迷宫实验逃避潜伏期和穿越平台次数比较比较(x¯±s) 
组别 只数
逃避潜伏期/s 穿越平台次数/次
第1天 第2天 第3天 第4天
假手术组 10 33.05±6.36 22.34±4.68 16.28±5.02 11.03±2.12 2.75±0.43
模型组 10 74.56±10.67① 70.35±9.13① 56.27±8.36① 33.15±7.01① 1.35±0.30①
恒清Ⅰ号方低剂量组 10 68.37±8.13 65.18±8.02 50.36±7.28 27.33±5.14 1.43±0.32
恒清Ⅰ号方中剂量组 10 53.43±7.36②③④ 49.63±6.74②③④ 32.16±5.59②③④ 22.67±3.75②③④ 2.01±0.37②③④
恒清Ⅰ号方高剂量组 10 43.32±6.17②③ 27.14±5.10②③ 25.25±6.12②③ 15.64±2.36②③ 2.50±0.46②③
欧来宁组 10 57.37±7.69②③④ 47.24±6.32②③④ 31.19±6.41②③④ 23.84±4.87②③④ 1.45±0.36②③④
2.2 各组大鼠海马组织中TNF-α、NF-κB含量比较
模型组大鼠海马组织中TNF-α、NF-κB含量均明显高于假手术组(P均<0.05)。恒清Ⅰ号方中、高剂量组和欧来宁组大鼠海马组织中TNF-α、NF-κB含量均明显低于模型组和恒清Ⅰ号方低剂量组(P均<0.05),且恒清Ⅰ号方高剂量组明显低于恒清Ⅰ号方中剂量组和欧来宁组(P均<0.05)。见表2。
表2 各组大鼠海马组织中TNF-α、NF-κB含量比较(x¯±s,pg/mL) 
组别 只数 TNF-α NF-κB
假手术组 10 37.24±4.31 25.36±4.28
模型组 10 75.36±10.42① 48.55±9.67①
恒清Ⅰ号方低剂量组 10 69.56±7.54 44.08±8.26
恒清Ⅰ号方中剂量组 10 58.43±6.73②③④ 38.44±6.07②③④
恒清Ⅰ号方高剂量组 10 42.15±5.37②③ 30.36±5.40②③
欧来宁组 10 55.13±12.38②③④ 42.15±6.37②③④
2.3 各组大鼠海马组织中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值比较
与假手术组比较,模型组大鼠海马组织中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达量均明显降低(P均<0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值明显增高(P<0.05)。与模型组和恒清Ⅰ号方低剂量组比较,恒清Ⅰ号方中、高剂量组和欧来宁组大鼠海马组织中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达量均明显增高(P均<0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值明显降低(P均<0.05)。与恒清Ⅰ号方中剂量组和欧来宁组比较,恒清Ⅰ号方高剂量组PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达量更高(P均<0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值更低(P均<0.05)。见图1及表3。


图1 各组大鼠海马组织中PI3K、AKT、p-AKT、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达情况
表3 各组大鼠海马组织中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值比较(x¯±s) 
组别 只数 PI3K AKT p-AKT LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ
假手术组 10 1.82±0.45 1.32±0.26 1.43±0.25 0.12±0.03
模型组 10 1.23±0.40① 0.88±0.21① 0.81±0.19① 0.54±0.10①
恒清Ⅰ号方低剂量组 10 1.28±0.38 0.92±0.23 0.86±0.26 0.46±0.07
恒清Ⅰ号方中剂量组 10 1.39±0.46②③④ 1.02±0.25②③④ 0.92±0.27②③④ 0.35±0.05②③④
恒清Ⅰ号方高剂量组 10 1.67±0.53②③ 1.13±0.30②③ 1.22±0.32②③ 0.18±0.04②③
欧来宁组 10 1.49±0.48②③④ 0.98±0.27②③④ 0.95±0.25②③④ 0.17±0.05②③④

3 讨 论

1为假手术组;2为模型组;3为恒清Ⅰ号方低剂量组;4为恒清Ⅰ号方中剂量组;5为恒清Ⅰ号方高剂量组;6为欧来宁组
目前研究认为,炎性细胞因子和细胞自噬均参与了血管性痴呆的发病过程[6]。炎性细胞因子与血管性痴呆的神经病理损伤密切相关,实验研究发现血管性痴呆大鼠海马区TNF-α等炎症细胞因子水平明显升高[7]。NF-κB是炎性反应中重要的转录因子,可与多种炎性反应基因的启动子结合,触发炎症级联反应[8]。NF-κB的激活会导致胼胝体和海马白质损伤和神经元-突触丢失,最终导致认知功能下降[9]。
PI3K/Akt信号通路可以调节学习和记忆功能,其与血管性痴呆的发生、发展密切相关,主要体现在以下2个方面:①PI3K/Akt/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)/一氧化氮(NO)途径调节脑血流量以改善脑循环;②通过脑源性神经营养因子(BDNF)/酪氨酸激酶受体B(TrkB)/PI3K/Akt途径促进神经元存活而发挥神经保护作用[10]。
自噬是细胞在生理或病理因子作用下,由内质网或高尔基体等来源的双层膜包裹蛋白质和细胞器等待降解物形成自噬体,与溶酶体结合后形成自噬溶酶体并进行多种酶的消化及降解,分解的氨基酸、核苷酸、游离脂肪酸等可被细胞再利用以满足代谢需要和实现某些细胞器的更新过程[11]。微管相关蛋白1轻链3(MAP1-LC3)在自噬体形成过程中是必不可少的,是目前常用的自噬标记物。LC3是在细胞内合成的,经过Atg4的同源体hATG4B加工形成常规表达的LC3,即胞质可溶性的Ⅰ型LC3,细胞发生自噬时,LC3-Ⅰ可以经加工成为泛素化LC3-Ⅰ,并与磷脂酰乙醇胺结合于自噬溶酶体膜表面,形成Ⅱ型LC3蛋白,自噬发生后LC3-Ⅱ可以广泛的聚集在自噬体膜上[12]。因此检测LC3Ⅱ和LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值可以直接推断自体吞噬的程度,其中LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ可真实反映自噬发生过程。
本课题组前期临床研究证实,恒清Ⅰ号方可显著改善血管性痴呆患者的认知功能,总有效率为80.85%,而对照组(尼莫地平组)总有效率仅为 65.95%,恒清Ⅰ号方的疗效优于尼莫地平[3];另外恒清Ⅰ号方联合盐酸多奈哌齐可能通过改善血管性痴呆患者血液流变学指标,减轻炎症反应,降低氧化损伤,改善微循环,修复神经元细胞,保护中枢神经元,从而有效改善血管性痴呆患者日常生活能力及认知功能[4]。本实验结果显示,与模型组和恒清Ⅰ号方低剂量组比较,恒清Ⅰ号方中、高剂量组和欧来宁组大鼠逃避潜伏期明显缩短,穿越平台次数明显增多,海马组织中TNF-α、NF-κB含量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显降低,PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达量均明显升高;与恒清Ⅰ号方中剂量组和欧来宁组比较,恒清Ⅰ号方高剂量组大鼠逃避潜伏期更短,穿越平台次数更多,海马组织中TNF-α、NF-κB含量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值更低,PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达量更高。提示恒清Ⅰ号方量效关系呈正相关,且高剂量恒清Ⅰ号方的作用优于欧来宁。
综上所述,恒清Ⅰ号方可通过减轻炎症反应,阻滞细胞自噬,调节PI3K/AKT信号通路而改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力,并呈一定量效关系,高剂量恒清Ⅰ号方的作用更佳。

参考文献
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